從1977年第一代DNA測序技術(Sanger法)1,發展至今三十多年時間,測序技術已取得了相當大的發展,從第一代到第三代乃至第四代,測序讀長從長到短,再從短到長。雖然就當前形勢看來第二代短讀長測序技術在全球測序市場上仍然占有著絕對的優勢位置,但第三和第四代測序技術也已在這一兩年的時間中快速發展著。測序技術的每一次變革,也都對基因組研究,疾病醫療研究,藥物研發,育種等領域產生巨大的推動作用。

圖1:測序技術的發展歷程

生命體遺傳信息的快速獲得對于生命科學的研究有著十分重要的意義。以上(圖1)所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA雙螺旋結構以來,整個測序技術的發展歷程。

第一代測序技術

第一代DNA測序技術用的是1975年由桑格(Sanger)和考爾森(Coulson)開創的鏈終止法或者是1976-1977年由馬克西姆(Maxam)和吉爾伯特(Gilbert)發明的化學法(鏈降解). 并在1977年,桑格測定了第一個基因組序列,是噬菌體X174的,全長5375個堿基1。自此,人類獲得了窺探生命遺傳差異本質的能力,并以此為開端步入基因組學時代。研究人員在Sanger法的多年實踐之中不斷對其進行改進。在2001年,完成的首個人類基因組圖譜就是以改進了的Sanger法為其測序基礎,Sanger法核心原理是:由于ddNTP的2’和3’都不含羥基,其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵,因此可以用來中斷DNA合成反應,在4個DNA合成反應體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標記的ddNTP(分為:ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP),通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列(圖2)。這個網址為sanger測序法制作了一個小短片,形象而生動。

值得注意的是,就在測序技術起步發展的這一時期中,除了Sanger法之外還出現了一些其他的測序技術,如焦磷酸測序法、鏈接酶法等。其中,焦磷酸測序法是后來Roche公司454技術所使用的測序方法2–4,而連接酶測序法是后來ABI公司SOLID技術使用的測序方法2,4,但他們的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中斷DNA合成反應的dNTP。

圖2:Sanger法測序原理


2016年07月07日

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