承接前文,接下來主要講述第三代測序技術。

第三代測序技術

測序技術在近兩三年中又有新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies納米孔單分子測序技術,被稱之為第三代測序技術。與前兩代相比,他們最大的特點就是單分子測序,測序過程無需進行PCR擴增。

其中PacBio SMRT技術其實也應用了邊合成邊測序的思想,并以SMRT芯片為測序載體。基本原理是: DNA聚合酶和模板結合,4色熒光標記 4 種堿基(即是dNTP),在堿基配對階段,不同堿基的加入,會發出不同光,根據光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。同時這個 DNA 聚合酶是實現超長讀長的關鍵之一,讀長主要跟酶的活性保持有關,它主要受激光對其造成的損傷所影響。PacBio SMRT技術的一個關鍵是怎樣將反應信號與周圍游離堿基的強大熒光背景區別出來。他們利用的是ZMW(零模波導孔)原理:如同微波爐壁上可看到的很多密集小孔。小孔直徑有考究,如果直徑大于微波波長,能量就會在衍射效應的作用下穿透面板而泄露出來,從而與周圍小孔相互干擾。如果孔徑小于波長,能量不會輻射到周圍,而是保持直線狀態(光衍射的原理),從而可起保護作用。同理,在一個反應管(SMRTCell:單分子實時反應孔)中有許多這樣的圓形納米小孔, 即 ZMW(零模波導孔),外徑 100多納米,比檢測激光波長小(數百納米),激光從底部打上去后不能穿透小孔進入上方溶液區,能量被限制在一個小范圍(體積20X 10-21 L)里,正好足夠覆蓋需要檢測的部分,使得信號僅來自這個小反應區域,孔外過多游離核苷酸單體依然留在黑暗中,從而實現將背景降到最低。另外,可以通過檢測相鄰兩個堿基之間的測序時間,來檢測一些堿基修飾情況,既如果堿基存在修飾,則通過聚合酶時的速度會減慢,相鄰兩峰之間的距離增大,可以通過這個來之間檢測甲基化等信息(圖7)。SMRT技術的測序速度很快,每秒約10個dNTP。但是,同時其測序錯誤率比較高(這幾乎是目前單分子測序技術的通病),達到15%,但好在它的出錯是隨機的,并不會像第二代測序技術那樣存在測序錯誤的偏向,因而可以通過多次測序來進行有效的糾錯。

圖7.PacBio SMRT測序原理

Oxford Nanopore Technologies公司所開發的納米單分子測序技術與以往的測序技術皆不同,它是基于電信號而不是光信號的測序技術5。該技術的關鍵之一是,他們設計了一種特殊的納米孔,孔內共價結合有分子接頭。當DNA堿基通過納米孔時,它們使電荷發生變化,從而短暫地影響流過納米孔的電流強度(每種堿基所影響的電流變化幅度是不同的),靈敏的電子設備檢測到這些變化從而鑒定所通過的堿基(圖8)。

該公司在去年基因組生物學技術進展年會(AGBT)上推出第一款商業化的納米孔測序儀,引起了科學界的極大關注。納米孔測序(和其他第三代測序技術)有望解決目前測序平臺的不足,納米孔測序的主要特點是:讀長很長,大約在幾十kb,甚至100 kb;錯誤率目前介于1%至4%,且是隨機錯誤,而不是聚集在讀取的兩端;數據可實時讀取;通量很高(30x人類基因組有望在一天內完成);起始DNA在測序過程中不被破壞;以及樣品制備簡單又便宜。理論上,它也能直接測序RNA。

納米孔單分子測序計算還有另一大特點,它能夠直接讀取出甲基化的胞嘧啶,而不必像傳統方法那樣對基因組進行bisulfite處理。這對于在基因組水平直接研究表觀遺傳相關現象有極大的幫助。并且改方法的測序準確性可達99.8%,而且一旦發現測序錯誤也能較容易地進行糾正。但目前似乎還沒有應用該技術的相關報道。

圖8. 納米孔測序

其他測序技術

目前還有一種基于半導體芯片的新一代革命性測序技術——Ion Torrent6。該技術使用了一種布滿小孔的高密度半導體芯片, 一個小孔就是一個測序反應池。當DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA鏈上時,會釋放出一個氫離子,反應池中的PH發生改變,位于池下的離子感受器感受到H+離子信號,H+離子信號再直接轉化為數字信號,從而讀出DNA序列(圖9)。這一技術的發明人同時也是454測序技術的發明人之一——Jonathan Rothberg,它的文庫和樣本制備跟454技術很像,甚至可以說就是454的翻版,只是測序過程中不是通過檢測焦磷酸熒光顯色,而是通過檢測H+信號的變化來獲得序列堿基信息。Ion Torrent相比于其他測序技術來說,不需要昂貴的物理成像等設備,因此,成本相對來說會低,體積也會比較小,同時操作也要更為簡單,速度也相當快速,除了2天文庫制作時間,整個上機測序可在2-3.5小時內完成,不過整個芯片的通量并不高,目前是10G左右,但非常適合小基因組和外顯子驗證的測序。

圖9. Ion Torrent


2016年07月07日

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